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本制品是百奥莱博供公司以染料法qRT-PCR技术为基础开发的，专门用于猴免疫缺陷病毒(SIV)研究检测的试剂盒。

猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus)是一种RNA病毒，其基因组为单链正链RNA，全长约9600～9700nt。该病毒主要通过血液、性接触和母婴途径在灵长类动物间传播。SIV感染其天然宿主时通常不致病，但若感染非天然宿主如亚洲恒河猴，则会导致类似人类艾滋病(AIDS)的严重免疫缺陷病症，表现为体重下降、机会性感染和淋巴细胞耗竭等。SIV的研究具有极其重要的科学意义，它不仅可以揭示人类免疫缺陷病毒(HIV)的起源、进化、致病机制，还可以为评估疫苗和治疗方法等提供模型。因此，快速检测猴免疫缺陷病毒具有重要的意义。

1. 一站式，用户不需要单独准备每种成分，只需要提供RNA样品。
   
2. 基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10～100倍，可以达到100拷贝/反应。
   
3. 根据猴免疫缺陷病毒的保守序列设计引物，具有良好的特异性，不会跟其它生物的RNA发生交叉反应。
   
4. 使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
   
5. 本制品可用于定性检测，也可用于定量检测。定量检测时线性范围至少有5个数量级。
   
6. 本制品足够50次20μL体系的qRT-PCR反应。
   
7. 本制品只能用于科研。

SIV qRT-PCR引物干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入110μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头。
   
2. 换枪头，在6号管中加入5μL 10⁷拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
3. 换枪头，在5号管中加入5μL 10⁶拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
4. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

5. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照，加水后其总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样品体积一样。可以用水作为核酸制备的阴性对照NC。
   
6. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒样品RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

7. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
8. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：
   

   成分	样品管 N+2个	RT-PCR 阴性对照	RT-PCR 阳性对照(1～6管)
   2×SYBR qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各10μL
   SIV qRT-PCR引物混合物	2μL	2μL	各2μL
   N+2个RNA模板	7μL	不加	不加
   自备超纯水	不加	7μL	不加
   6个阳性对照稀释液	不加	不加	各7μL
   SYBR qRT-PCR酶混合液v2	1μL	1μL	1μL

9. 上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
   

   过程	温度	时间
   RT(逆转录)	50℃	30min
   预变性	95℃	2min
   RT-PCR反应 (36个循环)	95℃	15sec
   	56℃	15sec
   	72℃	15sec(采集SYBR通道的荧光信号)
   按仪器预设程序进行溶解曲线分析

   注：部分(如：伯乐CFX96)机型如果三步法效果不理想可采用两步法：50℃ 30分钟，95℃ 2分钟，(94℃ 15秒、60℃ 60秒)循环36次，每个循环第二步采集荧光信号。

10. 通过溶解曲线分析排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品结果，归为假阳性，此样本Ct数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
    
11. 如果两种阴性对照(样品制备阴性对照和PCR阴性对照)的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。如果两种阳性对照(样品制备阴性对照和PCR阴性对照)无Ct值则无效。
    
12. 如果两种阴性对照(样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照)是假阳性，有Ct但Tm与阳性样本不同，实验有效可以继续分析其它样品有效数据。
    
13. 对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再换算出待测样品的RNA浓度。
    
14. 对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。